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 NuRNA™ Human tRNA Modification Enzymes PCR芯片技术服务

      tRNA是基因与蛋白之间重要的信息传递者,通过与特定氨基酸结合而发挥功能。越来越多的文献表明,tRNA及其来源的RNA片段(tRFs)在细胞增殖、分化、代谢、应激反应以及多种疾病中发挥着调控作用[1]。tRNA携带种类丰富、数目众多的转录后修饰。这些修饰为tRNA功能发挥所必需,参与tRNA的正确折叠,稳定维持和基因解码功能。比如,位于颈环部位的修饰影响tRNA的折叠与稳定性,反密码子环上的修饰确保翻译准确性,34号位置的修饰决着密码子的摆动性,反密码子环附近的修饰调控密码子与反密码子识别(图1)。
      tRNA修饰受各类tRNA修饰相关蛋白的动态调控[2],这些蛋白突变或者功能紊乱,与多种疾病的发生有关。例如,NSUN2负责催化胞嘧啶5’甲基化,其突变会导致机体头小畸形症[3];t6A甲硫基转移酶CDKAL1功能紊乱可诱发Ⅱ型糖尿病[4]。tRNA修饰对于疾病治疗的重要性,以及这些修饰是如何被调控,仍待进一步的研究[5,6]

图1. 人类tRNA修饰类型与修饰相关蛋白。

      美国Arraystar公司最新发布了市场上首款聚焦tRNA修饰蛋白检测的PCR芯片 ——NuRNA™ tRNA Modification Enzymes PCR Array。参考已有文献与权威数据库(UniProt和Modomics),此款芯片囊括了85个tRNA修饰酶和蛋白因子,覆盖了所有已知的tRNA修饰酶。PCR芯片上的每对引物在多个组织和细胞系中通过了严格验证。

产品信息:

服务名称
芯片
 规格
描述
NuRNA™ Human tRNA Modification Enzymes PCR Array Service NEW
NuRNA™ Human tRNA Modification Enzymes PCR Array
384-well(4*96)/ plate
同时检测85个tRNA修饰酶及相关蛋白因子

芯片特点:
• 覆盖度广—囊括了UniProt与Modomics中所有已知的tRNA修饰酶/蛋白因子
• 严谨性强—所有引物都通过了多样本严格验证
• 快速简易—即用型384孔板规格,只需将cDNA与qPCR Master Mix混合试剂加入PCR板中,4小时内得到实验结果。cDNA无需预先扩增。

表1.tRNA修饰酶/蛋白因子(修饰类型)

tRNA修饰及相关蛋白 (85):
ADAT1(m1I37), ADAT2(m1I34), ADAT3(-), ALKBH1(mcm5U), ALKBH8(mchm5U34/mcm5s2U34/mcm5U34/mcm5Um34), C9orf64(-), CDK5RAP1(ms2A37/ms2 i6A37), CDKAL1(ms2A37/ms2 i6A37), CDKL1(ms2t6A), CTU1(mcm5S2U ), CTU2(mcm5S2U), DUS1L(D16/17), DUS2(D20), DUS3L(D47), DUS4L(D), ELP3(-), ELP4(mcm5s2U), FBLL1(-), FTSJ1(Cm32/Gm34), GTPBP3(tm5U34), HSD17B10(m1A9/m1G9), IKBKAP(-), KIAA0391(m1A9/m1G9), KIAA1456(Um), LAGE3(t6A37), LCMT2(o2yW), METTL1(m7G46), METTL2A(Cm), METTL2B(3mC), MOCS3(mcm5S2U ), MTO1(tm5U34), NAT10(Ac4C), NFS1(s2U34/tm5s2U34), NSUN2(m5C49), NSUN6(m5C72), OSGEP(t6A37), OSGEPL1(t6A37), PUS1(pseudouridine27/pseudouridine28), PUS10(pseudouridine 55), PUS3(pseudouridine39), PUS7L(pseudouridine), PUSL1(pseudouridine), QTRT1 (Q34), QTRT2 (Q34), RPUSD1(pseudouridine), RPUSD2(pseudouridine31/pseudouridine32), RPUSD3(pseudouridine), RPUSD4(pseudouridine31/pseudouridine32), SSB(-), TARBP1(-), THUMPD1(Acetylcytidine), THUMPD2(Gm), THUMPD3(Gm), TP53RK(t6A37), TPRKB(t6A37), TRDMT1(m5C38), TRIT1(i6A37), TRMO(m6t6A), TRMT1(m2G26/m22G26), TRMT10A(m1G9), TRMT10B(m1G9), TRMT10C(m1A9/m1G9), TRMT11(m2G10), TRMT112(mchm5U34/mcm5s2U34/mcm5U34/mcm5Um34), TRMT12(o2yW), TRMT13(m4C/m4A ), TRMT1L(m2G26/m22G26), TRMT2A(Um), TRMT2B(m5U54), TRMT44(Um44), TRMT5(m1G37/o2yW), TRMT6(m1A58), TRMT61A(m1A58), TRMT61B(m1A58), TRMU(s2U34/tm5s2U34), TRUB1(pseudouridine), TRUB2(pseudouridine55), TYW1(o2yW), TYW1B(o2yW), TYW3(o2yW), TYW5 (o2yW), UBA5(cyclic t6A), URM1(mcm5S2U), WDR4(m7G46), YRDC(t6A37)

注:tRNA修饰缩写参考Modomics数据库,基因名参考UniProt。

PCR芯片实验流程
1. RNA抽提与质量检测
进行RNA常规抽提,使用NanoDrop ND-1000检测RNA浓度和纯度,使用琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性。详细的样品QC结果见Arraystar服务报告。
2. cDNA合成
每样本取1.5 μg RNA,使用rtStar™ First-Strand Synthesis Kit (Cat# AS-FS-001, Arraystar) 试剂盒合成cDNA第一链。详细步骤参照Arraystar产品操作手册。
3. Real-time PCR扩增
将cDNA与 Arraystar SYBR Green qPCR Master Mix (Cat# AS-MR-005-5, Arraystar)混合,加入至384孔板中,在ABI 7900 PCR仪上进行Real-time PCR扩增。
4. 熔解曲线分析与原始数据导出
PCR扩增完成后,进行熔解曲线分析,使用PCR仪自带软件导出原始数据。出具Raw Data文件夹,包含原始Ct值、PCR扩增曲线图和熔解曲线图。


PCR芯片数据分析流程
1. PCR芯片数据质控

质控参数:Ct(Blank)>35; Ct(GDC)>35; Ct(RNA Spike-in)<25; Ct (PPC) <25. 符合上述条件的样本进入下一步分析。
2. 数据校正与△Ct值计算
板间校正:使用Ct(PPC)对不同PCR板进行板间校正。
内参校正与△Ct值计算:挑选最优内参,使用内参均值计算△Ct值。
3. 差异倍数计算 (2^(-△△Ct))
使用 △△Ct 方法计算不同样品组之间的表达差异倍数。
4. P值计算
对样本组进行t检验,计算P值。
5. 其他常规数据分析
散点图分析;火山图分析;TOP20表达上调和下调transcript柱形图分析
6. 提供服务报告与数据分析结果
a. Arraystar服务报告(包括RNA样本QC和详细实验数据分析步骤)
b. Excel芯片结果汇总表(包括Transcript列表,数据分析结果和各类图表)
c. Raw Data文件夹 (包含原始数据、扩增曲线图和熔解曲线图)

NuRNA™ Human tRNA Modification Enzymes PCR芯片服务部分结果展示
1. 差异表达转录本列表(默认筛选参数:差异倍数>2;P<0.05,客户可指定筛选参数值)

2. 散点图 (黑色斜线代表差异倍数为1,红色斜线代表差异倍数为2)

3. 火山图(黑色垂线代表差异倍数为1;粉色垂线代表上调或下调倍数为2;蓝色水平线代表P值为0.05)


4. TOP20表达上调transcript柱状图

5. TOP20表达下调transcript柱状图


 

参考文献:
[1] Kirchner S, Ignatova Z. Emerging roles of tRNA in adaptive translation, signalling dynamics and disease. Nature reviews Genetics 2015;16:98-112.
[2] El Yacoubi B, Bailly M, de Crecy-Lagard V. Biosynthesis and function of posttranscriptional modifications of transfer RNAs. Annual review of genetics 2012;46:69-95.
[3] Blanco S, Dietmann S, Flores JV, Hussain S, Kutter C, Humphreys P, et al. Aberrant methylation of tRNAs links cellular stress to neuro-developmental disorders. The EMBO journal 2014;33:2020-39.
[4] Zhou B, Wei FY, Kanai N, Fujimura A, Kaitsuka T, Tomizawa K. Identification of a splicing variant that regulates type 2 diabetes risk factor CDKAL1 level by a coding-independent mechanism in human. Human molecular genetics 2014;23:4639-50.
[5] Zhang X, Cozen AE, Liu Y, Chen Q, Lowe TM. Small RNA Modifications: Integral to Function and Disease. Trends in molecular medicine 2016.
[6] Suzuki T, Nagao A, Suzuki T. Human mitochondrial tRNAs: biogenesis, function, structural aspects, and diseases. Annual review of genetics 2011;45:299-329.

 


mRNA
产品信息
NuRNA™ Human Central Metabolism PCR Array
NuRNA™ Human Epitranscriptomics PCR Array
NuRNA™ tRNA Modification Enzymes PCR Array
NuRNA™ Small RNA Biogenesis Proteins PCR Array
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