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 RNA-蛋白相互作用

技术简介
      作为基因组DNA的直接产物,RNA对生命活动有着至关重要的意义,是生命活动的又一执行者:1、参与蛋白质的合成;2、参与转录后修饰和DNA修复;3、参与基因表达调控等。对于一种特定的RNA(如,lncRNA,mRNA,circRNA,microRNA,tRF&tiRNAs等),往往具有与之对应的相互作用蛋白共同执行特定的生理功能,以lncRNA为例,近年来,lncRNAs在基因表达调控方面的重要功能越来越被人们所关注,但它们的具体功能还有待阐明。LncRNA可能通过4种作用机制参与基因调控:Decoy,作为诱饵分子,替代蛋白与DNA的相互作用;Scaffold,作为骨架分子,为蛋白复合体提供空间支撑作用;Guide,作为引导分子,介导蛋白-蛋白、蛋白DNA/RNA相互识别;Enhancer,作为增强子类似组件,促进基因表达[1] 。运用RNA亲和纯化技术(eg. ChIRP-MS,RAP-MS[2]),构建特定RNA相互作用蛋白谱,对阐明RNA的生理病理机制至关重要。

图1. lncRNA作用机制模型。

技术原理
      根据目标RNA的尺寸大小,可采用两种相似的技术策略:
      长链RNA:例如,lncRNA、circRNA、mRNA等常采用RNA Antisense Purification – Mass Spectrometry策略。生物样品在非变性条件下裂解和UV交联,或者不裂解直接在原位进行UV交联,随后用biotin标记的RNA anti-sense进行杂交(Control组采用非特异anti-sense或预先用RNase处理)。
      短链RNA:例如,micoRNA、tRF&tiRNA等通常采用RNA Affinity Purification – Mass Spectrometry策略。体外合成biotin标记的目标RNA(Control组采用scramble RNA),加入到非变性裂解的生物样品中,孵育替换内源的RNA。
      随后,通过固定化avidin对biotin进行pull-down,得到的RBP经LC-MS/MS鉴定和定量分析,与目标RNA特异性相互作用的蛋白(A, B, C, D)在两组间具有显著差异,非特异相互作用蛋白(X)在两组间比例接近1:1。据此构建目标RNA的相互作用蛋白谱。

图2.RAP-MS技术原理和实验流程。

案例展示1
      运用ChIRP-MS技术 (和RAP-MS技术原理相同的技术,a),Stanford大学的科研人员对Xist RNA的相互作用蛋白谱进行了研究,发现81种Xist RNA相互作用蛋白,对Xist的功能行使具有重要意义。[3]
      首先,为了对ChiRP-MS方法进行验证,作者选择了两种已知的snRNA,U1/U2(参与剪接体的组装)进行验证实验。U1/U2具有很高的表达量,同时,剪接体的组分研究得较为清楚,另外,U1/U2在抑制未成熟mRNA的剪接和poly-A化方面的作用已见报道,预示着更多未知的相互作用蛋白可能被鉴定到,因此U1/U2很适用于ChIRP-MS方法验证。针对U1/U2设计anti-sense RNA进行ChIRP-MS实验,结果如下:U1和U2分别富集了418和370个蛋白,其中113个已知的剪接体蛋白(共143个)(c)。

      相互作用网络图进一步展示了U1/U2互作蛋白富集情况:位于上部的为已知蛋白,主要为剪接体蛋白,位于下方的为功能未知蛋白,包括只与U1或U2互作的蛋白以及和两者共同作用的蛋白。ChIRP-MS技术不仅能够很好的鉴定已知的RNA互作蛋白,同时也能鉴定未知蛋白,是研究RNA-protein相互作用的强大工具。

案例展示2
      在多种应激条件下,tRNA能够发生特异性酶切,产生一类功能独特的tRNA片段(tRFs),和许多生理病理过程密切相关。来自Rockefeller University的科学家通过高通量测序技术发现一类tRFs特异性高表达于高转移性乳腺癌细胞中,并具有特定的motif,据此推测,细胞中可能存在某些与之特异性识别的蛋白质。为了鉴定这些未知的相互作用蛋白,作者运用RNA亲和纯化技术,用biotin标记的tRFs片段进行pull down(短链RNA RAP-MS技术),结合LC-MS/MS鉴定和定量分析,发现一个潜在的结合蛋白YBX1,并进行了深入研究。结果表明,YBX1蛋白能够与肿瘤转移相关基因mRNA结合并稳定mRNA,而tRFs可与mRNA竞争性结合YBX1,进而使肿瘤转移相关的mRNA去稳定性,抑制肿瘤的转移性。[4]

参考文献
1.Rinn, J. L. & Chang, H. Y. Genome regulation by long noncoding RNAs. Annual review of biochemistry 81, 145-166, doi:10.1146/annurev-biochem-051410-092902 (2012). [PMID: 22663078].
2.McHugh, C. A. et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature 521, 232-236, doi:10.1038/nature14443 (2015). [PMID: 25915022].
3.Chu, C. et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell 161, 404-416, doi:10.1016/j.cell.2015.03.025 (2015). [PMID: 25843628].
4.Goodarzi, H. et al. Endogenous tRNA-Derived Fragments Suppress Breast Cancer Progression via YBX1 Displacement. Cell 161, 790-802, doi:10.1016/j.cell.2015.02.053 (2015). [PMID: 25957686].


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