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 NuRNA™ Human Epitranscriptomics PCR芯片技术服务

      近年来,RNA修饰所介导的基因表达调控不断取得突破性进展,直接导致了表观转录组学(Epitranscriptomics)的诞生。最新研究发现,m6A、m5C、m1A、hm5C、甲尿嘧啶(ψ)与肌苷(I)等多种表观转录修饰存在于mRNA上,影响mRNA的代谢与功能[1] ,是一种重要的基因表达调控方式(图1)。这些表观转录组修饰由特定的酶添加(Writer)或去除(Eraser),可被特定的蛋白识别(Reader)。表观转录修饰水平的异常,以及相关酶或蛋白的异常,与许多疾病的发生紧密关联。
      m6A是真核生物mRNA上含量最丰富的表观转录修饰,参与调控mRNA的二级结构、剪切、成熟、细胞定位与翻译等过程。m6A由甲基转移酶复合物(包含METTL3,METTL14,WTAP,KIAA1429,RBM15,RBM15B)催化产生,可被去甲基化酶ALKBH5或FTO去除。目前已发现了多种特异性识别m6A位点的蛋白或复合物,包括YTH家族蛋白(YTHDF1-3, YTHDC1)、转录起始复合物eIF3、核糖核蛋白(HNRNPA2B1,HNRNPC)以及RNA结合蛋白SRSF2(表1)。m6A的动态调控在减数分裂与细胞多潜能分化等过程中发挥着重要作用[3] 。与正常组织相比,肿瘤干细胞中的m6A修饰水平显著升高。高水平的m6A增强了多个关键肿瘤基因的蛋白表达,从而促进肿瘤干细胞的增殖与肿瘤的发生发展,且常与不良预后有关。此外,METTL3[4] 、FTO[2]及ALKBH5[5]等表观转录相关蛋白因子在肿瘤的发生发中也发挥着关键性作用。在病毒RNA上也检测到了m6A修饰,其与病毒感染及复制有关。
      显而易见,表观转录修饰与表观转录修饰相关蛋白在基因表达调控中发挥着至关重要的作用。然而,目前对其研究才刚刚起步。为了帮助研究人员更方便快捷的进行表观转录组学研究,Arraystar开发了市场上首款检测表观转录修饰相关蛋白因子的PCR芯片。此款芯片可同时检测89个已知的或潜在的表观转录修饰相关蛋白,是表观转录研究的强有力工具。



图1. mRNA表观转录修饰及其生物学功能。

表1. 已发现的人属mRNA修饰酶(writer)、去修饰酶(Eraser)和修饰识别蛋白(Reader)。

 
m6A
m5C
I
ψ
m1A
Writers
KIAA1429
METTL3
METTL4
METTL14
RBM15
RBM15B
WTAP
NSUN2
TRDMT1
ADAR
ADARB1
ADARB2
DKC1
PUS1
PUS7
TRUB1
None identified
Erasers
ALKBH5
FTO
TET1
TET2
TET3
None identified
None identified
ALKBH1
ALKBH3
 
Readers
YTH Family
eIF3 complex
HNRNPA2B1
HNRNPC        
SRSF2
None identified
None identified
None identified
None identified

 


产品信息:

芯片
 规格
描述
NuRNA™ Human Epitranscriptomics PCR Array Service NEW!
384-well(4*96)/ plate
同时检测89个已知的或潜在的表观转录修饰相关蛋白

片特点:
• 覆盖度广
—覆盖了所有目前已知的表观转录修饰相关蛋白
• 转录本水平检测—检测编码Uniprot经典蛋白的转录本
• 严谨性强—所有引物都通过了多样本严格验证
• 快速简易—即用型384孔板规格,只需将cDNA与qPCR Master Mix混合试剂加入PCR板中,4小时内得到实验结果。cDNA无需预先扩增。

表观转录修饰相关蛋白检测列表
m6A
Writers: KIAA1429, METTL14, METTL3, METTL4, RBM15, RBM15B, WTAP
Readers: DGCR8, EIF3A, EIF3B, ELAVL1, HNRNPA2, HNRNPB1, HNRNPC1, HNRNPC2, SRSF2, YTHDC1, YTHDC2, YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3
Erasers: ALKBH5, FTO
m1A
Writers: HSD17B10, KIAA0391, TRMT10C, TRMT6, TRMT61A, TRMT61B
Erasers: ALKBH1, ALKBH3
m5C
Writers: DNMT1 , DNMT3A, DNMT3B, DNMT3L, NOP2, NSUN2, NSUN3, NSUN4, NSUN5, TRDMT1
Readers: MECP2, UHRF1
Erasers: TET1, TET2, TET3
hm5C
Writers: TET1, TET2, TET3
Readers: CHTOP, EGR1, ERH, HMCES, MEP50, MGME1, NEIL1, PRMT1, PRMT5, SMUG1, TDG, THYN1, WDR76, WT1
Inosine
Writers: ADAD1, ADAD2, ADAR, ADARB1, ADARB2, ADAT1, ADAT2, ADAT3
Pseudouridine
Writers: DKC1, GAR1, NAF1, NHP2, NOP10, PUS1, PUS10, PUS3, PUS7, PUS7L, PUSL1, RPUSD1, RPUSD2, RPUSD3, RPUSD4, TRUB1, TRUB2
Other modifications (m7G)
CMTR1, CMTR2, RNGTT, RNMT


PCR芯片实验流程
1.RNA抽提与质量检测
进行RNA常规抽提,使用NanoDrop ND-1000检测RNA浓度和纯度,使用琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性。详细的样品QC结果见Arraystar服务报告。
2.cDNA合成
每样本取1.5 μg RNA,使用rtStar™ First-Strand Synthesis Kit (Cat# AS-FS-001, Arraystar) 试剂盒合成cDNA第一链。详细步骤参照Arraystar产品操作手册。
3.Real-time PCR扩增
将cDNA与 Arraystar SYBR Green qPCR Master Mix (Cat# AS-MR-005-5, Arraystar)混合,加入至384孔板中,在ABI 7900 PCR仪上进行Real-time PCR扩增。
4.熔解曲线分析与原始数据导出
PCR扩增完成后,进行熔解曲线分析,使用PCR仪自带软件导出原始数据。出具Raw Data文件夹,包含原始Ct值、PCR扩增曲线图和熔解曲线图。


PCR芯片数据分析流程
1.PCR芯片数据质控
 质控参数:Ct(Blank)>35; Ct(GDC)>35; Ct(RNA Spike-in)<25; Ct (PPC) <25. 符合上述条件的样本进入下一步分析。
2.数据校正与△Ct值计算
板间校正:使用Ct(PPC)对不同PCR板进行板间校正。
内参校正与△Ct值计算:挑选最优内参,使用内参均值计算△Ct值。
3.差异倍数计算 (2^(-△△Ct))
使用 △△Ct 方法计算不同样品组之间的表达差异倍数。
4.P值计算
对样本组进行t检验,计算P值。
5.其他常规数据分析
散点图分析;火山图分析;TOP20表达上调和下调transcript柱形图分析
6.提供服务报告与数据分析结果
a.Arraystar服务报告(包括RNA样本QC和详细实验数据分析步骤)
b.Excel芯片结果汇总表(包括transcript列表,数据分析结果和各类图表)
c.Raw Data文件夹 (包含原始数据、扩增曲线图和熔解曲线图)

NuRNA™ Human Epitranscriptomics PCR芯片服务部分结果展示
1.差异表达转录本列表(默认筛选参数:差异倍数>2;P<0.05,客户可指定筛选参数值)


2.散点图 (黑色斜线代表差异倍数为1,红色斜线代表差异倍数为2)


3.火山图(黑色垂线代表差异倍数为1;粉色垂线代表上调或下调倍数为2;蓝色水平线代表P值为0.05)


4.TOP20表达上调transcript柱状图


5.TOP20表达下调transcript柱状图


参考文献
1. Gilbert, W.V., et al. (2016). Messenger RNA modifications: Form, distribution, and function. Science 352, 1408-1412, PMID:27313037.
2. Iles, M.M., et al. (2013). A variant in FTO shows association with melanoma risk not due to BMI. Nature genetics 45, 428-432, 432e421, PMID:23455637.
3. Klungland, A., et al. (2016). Reversible RNA modifications in meiosis and pluripotency. Nature methods 14, 18-22, PMID:28032624.
4. Lin, S., et al. (2016). The m(6)A Methyltransferase METTL3 Promotes Translation in Human Cancer Cells. Molecular cell 62, 335-345, PMID:27117702.
5. Zhang, C., et al. (2016). Hypoxia induces the breast cancer stem cell phenotype by HIF-dependent and ALKBH5-mediated m(6)A-demethylation of NANOG mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 113, E2047-2056, PMID:27001847.

 


 



mRNA
产品信息
NuRNA™ Human Central Metabolism PCR Array
NuRNA™ Human Epitranscriptomics PCR Array
NuRNA™ tRNA Modification Enzymes PCR Array
NuRNA™ Small RNA Biogenesis Proteins PCR Array
SABiosciences第二代功能分类基因芯片简介
全基因组表达谱基因芯片
信号转导PCR芯片
肿瘤PCR芯片
细胞因子与炎症反应PCR芯片
细胞和发育生物学研究PCR芯片
常见疾病研究PCR芯片
毒理和药理PCR芯片
细胞外基质与黏连分子PCR芯片
神经科学PCR芯片
细胞凋亡与细胞周期PCR芯片
其他PCR芯片
Arraystar RNA-Seq样品预处理试剂盒
技术服务
NuRNA™ Human tRNA Modification Enzymes PCR芯片技术服务
NuRNA™ Human Small RNA Biogenesis Proteins PCR芯片技术服务
NuRNA™ Human Epitranscriptomics PCR芯片技术服务
NuRNA™ Human Central Metabolism PCR芯片技术服务
mRNA甲基化测序(MeRIP-seq)技术服务
全基因组表达谱基因芯片技术服务
RNA测序技术服务
功能分类PCR芯片技术服务
mRNA实时定量PCR技术服务
生物信息学技术服务
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