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Exiqon microRNA PCR芯片技术服务
 
Exiqon miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR芯片检测平台,基于LNA™专利技术,采用独特的Universal RT反应,实现对microRNA的准确定量检测,即使在总RNA含量较低的样本,如FFPE和血清/血浆中,也可以获得高质量的microRNA检测结果。
康成生物为您提供Exiqon公司miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR芯片——microRNA实时定量PCR芯片技术服务,全部实验皆使用进口试剂完成,使用的定量PCR仪器为美国应用生物系统公司生产的荧光定量PCR仪ABI PRISM® 7700或ABI PRISM® 7900。PCR芯片技术服务的主要流程包括:RNA抽提、RNA质量检测、cDNA模板制备、实时定量PCR、数据处理及制作实验报告。

Exiqon miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR芯片列表
芯片名称
规格
物种
描述
microRNA Ready-to-Use PCR, Human panel I
384 well
372个常见的人类miRNA
microRNA Ready-to-Use PCR, Human panel I+II
384 well
752 个人类miRNA
microRNA Ready-to-Use PCR, Mouse&Rat panel I
384 well
小鼠,大鼠
372个常见的小鼠/大鼠miRNA
microRNA Ready-to-Use PCR, Mouse&Rat panel I+II
384 well
小鼠,大鼠
752 个小鼠/大鼠miRNA
Cancer Focus microRNA PCR Panel
96 well
84个癌症相关的miRNA
Serum/Plasma Focus microRNA PCR Panel
384 well
179个在血清、血浆样品中验证过的miRNA
Stem Cell Focus microRNA PCR Panel
96 well
85个与胚胎干细胞或多能诱导干细胞相关的miRNA

Exiqon的LNA™专利技术攻破MicroRNA PCR检测的两大难题
*  LNA™化学修饰提高引物和靶标分子的结合力,提高检测灵敏度,解决microRNA引物设计的难点:microRNA长度仅22nt左右,相当于一条普通oligo引物的长度,而PCR扩增需要上下游两条引物,因此传统的microRNA 的PCR方法仅一条引物为microRNA特异性,另一条采用通用引物,检测的特异性降低。 此外,microRNA的GC含量分布范围广: 5%-95%,由于A :T配对碱基的结合力要低于G :C配对,此GC含量低于50%的microRNA,即使整条序列都被一条普通的oligo引物覆盖,该引物的Tm值参数仍然难以达到PCR检测的要求(55-63℃),这个部分的microRNA用普通引物是不能得到有效扩增。LNA™专利技术能解决microRNA研究的难点,包括PCR检测。每个LNA™修饰位点能够提高引物Tm值3-8℃,因此在相同的PCR反应条件下(引物的Tm 值 60℃左右),可以通过加入LNA™缩短引物的长度,使得上下游都为microRNA特异性引物,PCR的特异性得到双重保障。而且更为重要的是,GC含量低的microRNA的PCR问题也能迎刃而解,控制加入LNA™的比例(GC含量低的microRNA检测引物加入多个LNA™修饰的碱基),使所有的microRNA都能得到有效的、均一的检测信号。
图1. 左图为LNA™( Locked Nucleic Acid )的化学结构,LNA是一种类寡核苷酸衍生物,提高引物和靶标分子的稳定性,能够增加引物的溶解温度(Tm值)。相同的Tm参数条件下,加入LNA可以缩短引物长度(右图)。
 
*  LNA™专利技术显著提高PCR反应的单碱基分辨能力,区分MicroRNA家族各成员: microRNA中存在多个家族(microRNA family),家族成员间序列相似性极高,个别成员间仅相差一个碱基。普通oligo引物无法分辨单碱基差异,即使有一个碱基错配也能继续PCR 反应,因此无法分辨极度相似的家族成员。LNA™修饰的引物具有单碱基分辨能力,其原理如下图所示。ΔTm=Tm(引物/完美匹配的靶标分子)-Tm(引物/单碱基错配靶标分子),加入LNA™后ΔTm值显著增加,PCR交叉反应的可能性大大降低。Tm(LNA 引物/单碱基错配)低于PCR反应温度,PCR反应条件下引物和错配分子处于解离单链状态不能进行PCR反应;Tm(LNA 引物/完美匹配靶标分子)高于60℃,产生有效的PCR扩增信号。

图2. 左图加入LNA™后ΔTm值显著增加,PCR交叉反应的可能性大大降低。右图,人工合成序列相似的microRNA 成员分子,用miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR平台检测。如表所示,交叉反应的信号极低,有些情况下甚至没有。       

Exiqon miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR芯片特点
1.灵敏度高:微量样本,无需预扩增,节省宝贵样本;对RNA量低的样本,如血清、血浆、FFPE、LCM等特殊样本尤其适用;LNA™ PCR系统检测单个microRNA仅需1pg总RNA(图3);而miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR芯片在仅仅40ng总RNA中就可以检测730种microRNA的表达;LNATM PCR芯片灵敏度是同类芯片的10倍以上

2.特异性强:经LNATM 优化的PCR引物,可有效区分microRNA间的单碱基差异,并能区分成熟和前体microRNA;同时使背景信号值最小;
3.准确性高:LNATM PCR芯片上的引物均经过了实验验证;反转录采用Universal RT对各种不同的microRNA同时进行反转录,减少技术误差;对AT含量高的microRNA同样有效。
4.质控严格:每个panel均包含6个内参和2组质控对照;基于SYBR green的PCR方法,还可以提供溶解曲线以判断扩增特异性(图4)
5.高重复性:简化实验步骤,减少技术误差,实验重复性好(图5)

Exiqon miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR 芯片如何实现高通量高质量的microRNA定量检测?
1. 独特的Universal RT反应:
     一次单链cDNA合成反应制备的cDNA可作为芯片所有microRNA PCR反应的模板(图6),减少操作步骤,消除技术误差,节省宝贵样本。同时避免了在芯片中使用混合RT引物对扩增特异性的影响。

6   Universal RT microRNA PCR反应原理

2. 基于LNA™专利技术的PCR扩增反应:
     实现引物Tm值均一,并同时保持microRNA扩增的高特异性和高灵敏度:
    miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR芯片中所使用的microRNA特异性的PCR引物(PCR扩增上下游引物)都经过LNA™优化,并且经过严格的验证,能有效区分序列只差一个碱基的microRNA,并能区别成熟microRNA和microRNA前体,从而保证对靶microRNA的特异性扩增;同时,显著降低背景信号,从而增强对低丰度microRNA的准确检测。

3. 严格的芯片内参照和质控设置:
     miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR芯片内设置了6个内参,包括:3个microRNA (hsa-miR-103, hsa-miR-191 and hsa-miR-423-5p),3个小RNA (U6, SNORD38B and SNORD49A)。这些内参在大量实验结果和多种组织的microRNA表达分析中均呈现出稳定的表达水平,但研究者也需要根据组织或细胞的实际情况选择最合适的、稳定表达的内参分析试验结果。
     同时,芯片内还设置了一个spike-in对照和一组3次重复的芯片间误差校正参照。

Exiqon miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR芯片应用
1. miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR芯片在LCM微量样本microRNA表达检测中的应用:
     由于miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR 芯片要求的样本量较其他平台更少,对于LCM等微量样本尤其适用。(图7)

2. miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR芯片在血清/血浆的microRNA检测中的应用:
   近年来,microRNA成为来源于血液来源的新生物学标记物,但由于采血量和microRNA分子大小及表达水平等限制,检测血液中的microRNA面临着诸多挑战。
      miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR芯片具有无与伦比的灵敏度和检测特异性,即使对血清/血浆等含微量总RNA的样本,也可实现对microRNA的高质量检测;并且无需对cDNA进行预扩增。(图8)


康成
Exiqon miRNA PCR芯片服务流程
1.样品RNA抽提
  a.实验对象为组织样品,取适量(50-100mg)新鲜组织样品或正确保存的组织样品,使用BioPulverizerTM冰冻粉碎组织,加1ml的RNA抽提试剂TRIzol(Invitrogen),使用Mini-Bead-Beater-16匀浆后抽提RNA。
  b.实验对象为细胞样品,每份样品取1×106~1×107细胞,加1ml的RNA抽提试剂TRIzol(样品为贴壁细胞,每10cm2培养皿TRIzol使用量为1ml),裂解后抽提RNA。
2.RNA质量检测
  a.使用Nanodrop测定RNA 在分光光度计260nm、280nm和230nm的吸收值,以计算浓度并评估纯度。
  b.用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳,检测RNA纯度及完整性。
  c.提供RNA QC报告。
3.cDNA合成
  按照Exiqon逆转录试剂盒使用说明将样品RNA逆转录为cDNA。
4.实时定量PCR
  按照芯片说明将cDNA模板适当稀释后加入到实时定量PCR反应混合液中,然后再含有基因特异性引物的96孔板各孔中加入等量反应液,进行实时定量PCR反应。
5.数据分析
  利用配套软件计算PCR芯片中的各个miRNA的Ct值,采用公认的DDCt方法比较基因的表达变化。
  a.计算每个处理组中的每个miRNA ΔCt 。
ΔCt (Ctrl) = average Ct – average of HK genes’ Ct for Ctrl array
ΔCt (Exp) = average Ct – average of HK genes’ Ct for Exp array
  b.计算2个PCR Array中每个基因的ΔΔCt。
ΔΔCt = ΔCt (Exp) - ΔCt (Ctrl)
  c.通过2-ΔΔCt计算Exp(实验组)与Ctrl(对照组)间基因的表达差异。
6.提供实验报告
  MiRNA table(miRNA列表)
  Excel芯片结果汇总表(包括芯片原始结果、数据分析和各种图表)
 
康成客户实例——Exiqon miRNA PCR芯片
1.分子标志物筛选
结肠癌分型marker(Identification of serum microRNA profiles in colon cancer. BJC.2013)
使用芯片:Exiqon miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR Panel
   
研究者通过比较:1)结肠癌和健康对照,2)早期和晚期结肠癌病人的血清microRNA表达,筛选得到了可以作为早期诊断标记物的21个microRNA。这些microRNA中的一部分与结肠癌组织和细胞水平的研究得到的microRNA有重叠,另外一部分则是在其他癌症中发现的重要的microRNA。由于microRNA的调控是一个复杂的网络,所以采用一组而不是某一个microRNA作为分子标记物会更加可靠。基于此研究成果,还将在更多的临床样本,不同种族的群体中进行microRNA标志物的验证。

2.功能机制研究
High dose glargine alters the expression profiles of microRNAs in pancreatic cancer cell, 2012, WJG)
   
甘精胰岛素(glargine)是临床上用于糖尿病治疗的药物,但与胰腺癌的患病风险风险提高有关,本研究从microRNA分子水平揭示其促癌的分子机制。首先应用Exiqon microRNA Ready- to- use human Panel I检测甘精胰岛素刺激下胰腺癌细胞(SW1990)的microRNA表达谱变化,筛选得到12个表达变化的microRNA其中miR-95的变化倍数最高。而后围绕着miR-95展开的细胞以及动物模型的实验并证明miR-95具有促进癌细胞增殖、转移,以及肿瘤组织生长的作用。

国内学者使用康成Exiqon microRNA PCR芯片服务发表的SCI成果
→  MiR-28-3p as a potential plasma marker in diagnosis of pulmonary embolism.Thromb Res.2015.

  Diagnostic value of a plasma microRNA signature in gastric cancer: a microRNA expression analysis.Sci Rep.2015.

  Identification of Differential MicroRNAs in Cerebrospinal Fluid and Serum of Patients with Major Depressive Disorder.PLoS One.2015. 

→  Plasma miR-122 and miR-192 as potential novel biomarkers for the early detection of distant metastasis of gastric cancer. Oncol Rep. 2014.

  Aberrant miRNA profiles associated with chronic benzene poisoning.Exp Mol Pathol.2014.

  Serum miR-19a Predicts Resistance to FOLFOX Chemotherapy in Advanced Colorectal Cancer Cases. Asian Pacific journal of cancer prevention.2013.

  High dose glargine alters the expression profiles of microRNAs in pancreatic cancer cells.World Journal of Gastroenterology.2012.

  Metformin alters the expression profiles of microRNAs in human pancreatic cancer cells. diabetes research and clinical practice.2012.


microRNA
产品信息
Exiqon公司microRNA芯片
Exiqon公司microRNA PCR芯片
Exiqon miRNA研究配套试剂
Arraystar公司miRStar™人肿瘤相关microRNA PCR芯片
Exiqon公司microRNA原位杂交检测探针及优化试剂盒
Exiqon公司microRNA LNA Knockdown探针
Arraystar公司miRStar™ qPCR配套试剂:SYBR® Green Master Mix
Arraystar公司miRStar™ qPCR配套试剂:cDNA Synthesis Kit
Arraystar公司miRStar™ qPCR配套试剂:microRNA特异性PCR引物
Arraystar miRStarTM Cancer Focus miRNA PCR研究配套试剂
技术服务
microRNA测序服务
microRNA芯片技术服务
miRStar™ Cancer Focus microRNA PCR芯片技术服务
microRNA实时定量PCR技术服务
microRNA PCR芯片技术服务
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