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 康成生物免疫印迹产品使用指南
简介
         1979年Towbin最先采用Western Blotting(也称之为免疫印迹)技术用于分析蛋白,该技术现已成为蛋白分析的一种常规技术。它是根据抗原抗体结合的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白。“印迹”是指蛋白质从凝胶转移到膜上的过程中同时保持它们的相对位置和分辨率。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。
         免疫印迹的主要操作过程分为三个步骤:1、蛋白质经凝胶电泳按分子量大小不同依次分离;2、将分离的蛋白转印(印迹)到印迹膜(通常是硝酸纤维素膜或PVDF膜);3、对转印到印迹膜的蛋白成分进行免疫学检测。化学发光检测法是最灵敏的检测法,底物在酶的催化下被氧化,释放的光子通过X胶片曝光,也可以用CCD检测系统或专为化学发光检测设计的磷屏成像系统检测。无论使用哪种底物,信号的强度与印迹膜上抗原的丰度呈正比。
         免疫印迹检测的具体操作过程存在很大差异。其中最常见的是直接和间接检测,间接检测法即一抗首先与抗原结合,再加入能与一抗特异结合标记过的二级抗体。标记物包括生物素、荧光探针(如荧光素和罗丹明)和酶(如HRP和AP)。这种方法的优点是单个二级抗体可测定多种多样的一级抗体从而避免了逐一标记一级抗体,另一方面一抗通常能与几个二抗分子结合,从而起了信号放大的作用。其缺点是一抗可能会与二抗发生交叉反应,产生非特异性条带,另一方面是检测过程增加了额外的温育步骤。与直接检测法相比,大多数研究者更喜欢用间接方法。
                       
图1:间接检测示意图:未标记的一抗与目的蛋白结合;洗膜去除未结合的一抗之后加标记的二抗孵育;二抗与一抗结合;洗膜去除未结合的二抗;最后加底物、二抗偶联的标记物催化底物反应产生可检测信号。
 
方法
一、蛋白质抽提
培养的贴壁动物细胞的总蛋白质抽提步骤

总蛋白抽提试剂 Cat.# KC-415
核蛋白抽提试剂 Cat.# KC-435
蛋白酶、磷酸酶抑制剂&PMSF
Cat.# KC-440
 
1、从贴壁细胞培养瓶中小心倾去培养液。
2、预冷的PBS清洗贴壁的细胞2次,小心倾去PBS。
3、配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂(1 ml抽提试剂中加入10 μl蛋白酶抑制剂混合液,10 μlPMSF
     和10 μl磷酸酶抑制剂混合液)。
4、细胞瓶中加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂(107个细胞中加入1 ml抽提试剂;5×106
     细胞中加入0.5 ml抽提试剂),轻轻摇动5分钟。
5、用一预冷的橡胶和塑料细胞刮将培养瓶壁上贴壁细胞刮下来,转移细胞悬浮液到离心管中,冰浴
     下摇动15分钟进行裂解。
6、裂解液于预冷的离心机中14,000 xg离心15分钟。弃去沉淀,上清液立刻转移入新的离心管中
     保存待用。

 
培养的悬浮动物细胞的总蛋白质抽提步骤
1、2,500 xg离心10分钟沉淀悬浮的细胞,弃去上清液
2、预冷的PBS悬浮沉淀细胞,2,500 xg离心10分钟沉淀细胞,去上清。
3、配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂(1 ml抽提试剂中加入10 μl蛋白酶抑制剂混合液,10 μlPMSF
     和10 μl磷酸酶混合液)。
4、加入含抑制剂的预冷蛋白质抽提试剂(107个细胞中加入1 ml抽提试剂;5×106个细胞中加入
     0.5 ml抽提试剂)
5、轻轻摇动混和15分钟进行裂解。
6、裂解液于预冷的离心机中14,000 xg离心15分钟。弃去沉淀,上清液立刻转移入新的离心管中
     保存待用。
 
哺乳动物组织的总蛋白质抽提步骤
1、组织称重,切小块放入管中。
2、配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂(1 ml抽提试剂中加入10 μl蛋白酶抑制剂混合液,10 μlPMSF
     和10 μl磷酸酶混合液)。
3、加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂(250 mg组织中加入1 ml抽提试剂)。
4、用匀浆器每次30秒低速匀浆,每次匀浆间隔冰浴1分钟,至组织完全裂解。
5、裂解液于预冷的离心机中14,000 xg离心15分钟。上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。
 
二、蛋白质定量
         蛋白质定量较常用的是Bradford法和BCA法。Bradford法的最大缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大,无可比性。BCA是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2+反应产生Cu+,后者与BCA形成螯合物,形成紫色化合物,吸收峰在562 nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极 强,反应后形成的化合物非常稳定。KC™ BCA蛋白质定量试剂(Cat.# KC-430)可检测0 – 1,000 µg / ml范围的蛋白浓度。
 

KC™ BCA蛋白质定量试剂盒
Cat.# KC-430
试剂盒组成
•  BCA试剂A          40 ml
•  BCA试剂B          1 ml
•  BSA标准蛋白        1 vial
(2,000 µl / ml)
•  稀释液                 10 ml
•  微孔板                 2 块

 
实验步骤
A、配置BCA工作液(WR):
1、每孔需配置200 μl的BCA工作液。
2、以50份BCA试剂A加1份BCA试剂B(50:1,试剂A:试剂B)的比例混合以配置BCA工作液
    (WR)。如10个孔的实验需要用2 ml试剂A混合40 μl试剂B。
 
B、步骤(样品与BCA工作液比例=1:8):
1、配制梯度稀释为1,000、500、250、125、62.5 µg / ml以及0.0 µg / ml的BCA标准品。
2、分别吸取25 µl标准品到微孔板的对应孔中。
3、分别吸取2.5 µl待测样品至微孔板对应孔中,并加入22.5 μl稀释液。
4、每孔加入200 µl的WR,震板30秒以彻底混合均匀。
5、盖好微孔板,37℃温育30分钟。
6、冷却至室温。
7、测量562 nm附近(540 – 590 nm皆可以使用)的各孔吸收值。
8、测得的每个标准孔和待测样品孔的吸收值分别减去空白孔平均光吸收值.
9、以校正过的BSA标准蛋白562 nm测量值对其浓度(μg / ml)做图绘制标准曲线。使用标准曲
     线定量待测样品蛋白浓度。
 
注意
•  最终得到的待测样品浓度需用标准曲线测量浓度乘以10倍。
•  实验中,测量波长从540 - 590 nm均可以使用。
•  若在大于562 nm的波长处进行测量,需将孵育时间延长至2小时。
 
三、电泳
         凝胶中聚丙烯酰胺浓度可以是均一浓度或是梯度浓度。最常用的聚丙烯酰胺浓度是10%。SDS-PAGE凝胶通常为1.0到1.5 mm厚;然而,蛋白质印迹最好使用更薄的胶(≤1 mm)。SDS是一种离子型去污剂,它能打开蛋白质分子之间的氢键和疏水键,使蛋白质变性成为松散的线状。同时大多数蛋白质的每一个氨基酸都能与固定量的SDS相结合,形成SDS复合物。由于SDS解离后带有很强的负电荷,致使SDS-蛋白质复合物都带上了相同密度的负电荷,其电量大大超过了蛋白质原有的电量,基本掩盖了不同蛋白质只见原有的电量差异。另一方面SDS与蛋白质结合后,改变了蛋白质原有构象,使所有蛋白质水溶液中的形状都近似椭圆柱形。因此蛋白质在凝胶中的迁移率主要取决于它自身的分子量大小。
         最常见的凝胶电泳缓冲液由Tris-glycine组成。缓冲液可以包含0.1%去污剂,通常是SDS。Tris-glycine可用于分离很宽分子量范围(6 - 200 kDa)的蛋白质,并且与变性或非变性条件相容。
 
10×电泳缓冲液配制
Tris碱30.3 g,甘氨酸144 g,SDS 10 g,双蒸水调至体积为1 L。
 
制备分离胶(pH 8.8
凝胶浓度
8%
10%
12.5%
30:0.8% w/v丙烯酰胺:双丙烯酰胺
2 ml
2.5 ml
3.1 ml
1.0M Tris-Cl pH 8.8
3 ml
3 ml
3 ml
20% SDS
38 μl
38 μl
38 μl
dH2O
2.43 ml
1.9 ml
1.3 ml
混合,灌胶前加入APS和TEMED
 
 
 
10% APS
36 μl
36 μl
36 μl
TEMED
5 μl
5 μl
5 μl
总体积
7.5 ml
7.5 ml
7.5 ml
         用注射器将配制好的溶液缓慢加入到装配好的板中至凝胶高度为6 cm左右,预留1.5 cm高度配制积层胶。每板凝胶溶液上覆盖0.1% SDS,放置1小时左右至聚合完全。
 
制备积层胶(pH 6.8
4%积层胶配合<10%的分离胶使用,6%积层胶配合>10%的分离胶使用。
积层胶浓度
4%
6%
30:0.8% w/v 丙烯酰胺:双丙烯酰胺
660 μl
1 ml
1M Tris-Cl pH6.8
630 μl
630 μl
20% SDS
25 μl
25 μl
dH2O
3.6 ml
3.6 ml
混合,灌胶前加入APS和TEMED
 
 
10% APS
25 μl
25 μl
TEMED
5 μl
5 μl
总体积
5 ml
5 ml
         使用Whatman 3 mm滤纸吸去分离胶上层覆盖的所有溶液,如上配制积层胶。用10 ml注射器将积层胶加入板中至顶端,小心插入梳子,注意不要产生气泡。凝胶聚合1小时左右。
         凝胶电泳前,拔去梳子,每孔均用1×电泳缓冲液清洗。上、下层电泳槽中加入1×电泳缓冲液,上层槽中缓冲液液面需超过上样孔顶端1 - 2 cm。BioRad电泳槽中需加入500 ml的1×电泳缓冲液(50 ml的10×储存液+450 ml dH20)。
 
上样
3×SDS上样缓冲液配制:
187.5 mM Tris-HCL(pH 6.8,置于25℃)
6% w/v SDS,
30% glycerol
150 mM DTT
0.03% 溴酚蓝
a、准备样品液:样品(40 – 60 μg总蛋白或10 – 20 μg核蛋白)与3×上样缓冲液2:1混合,
     煮沸3分钟。
b、将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准(使用生物素标记的分子量标准可以方便地
     在化学发光检测样品目的蛋白的同时也检测到相应的分子量标准,能更直观地判断目的蛋白大
     小)。分别上样,标准加进第一个孔中。
c、电泳:使用BioRad电泳装置,样品首先在20 mA恒定电流下电泳至染料接近分离胶顶端。然后
     60 mA恒定电流电泳至溴酚蓝刚出胶底部。凝胶电泳于4℃。
 
四、蛋白质转移
         电转移是最常用的蛋白质转移方法,其优点是速度快和转移更完全。转移缓冲液是一种Tris-甘氨酸缓冲液,常用于湿转系统。该缓冲液pH为8.3,比大多数蛋白质的等电点(pI)高,蛋白质带净负电荷并向阳极迁移。
1×转移缓冲液配制:25 mM Tris碱,0.2 M甘氨酸,20%甲醇(pH 8.5)
 
实验准备
1、制备足够转移缓冲液以充满转移槽,另外准备200 ml用于平衡凝胶和膜以及润湿滤纸。
2、从玻璃板上取下凝胶,去除所有浓缩胶。
3、将凝胶浸入转移缓冲液中15 - 30分钟。
4、滤纸在转移缓冲液中至少浸泡30秒。
5、准备膜:
a、硝酸纤维素膜:将膜进入转移缓冲液中15 - 30分钟
b、PVDF膜
•  在甲醇中润湿膜15秒,保证膜由不透明变成半透明。
•  小心将膜放入双蒸水水中浸泡2分钟。
•  小心将膜放入转移缓冲液中平衡至少5分钟。
 
操作步骤
1、按照泡沫、滤纸、凝胶、转印膜、滤纸、泡沫的顺序组装转移夹层。
2、将转移夹放入转移槽中,确保转移夹的凝胶侧面向阴极(-)而膜侧面向阳极(+)。
3、向转移槽中加入适量缓冲液,确保将转移夹完全浸没。
4、将黑色电极引线(-)插入转移装置的阴极插孔,红色阳极引线(+)插入阳极插孔。
5、连接阳极和阴极引线至对应的电源输出端。
6、转膜装置置于冰水中,打开电源40 mA过夜或200 mA 2小时。
7、转移完成后,从槽中取出转移夹。
8、用镊子小心打开转移叠层。
9、在双蒸水中漂洗膜。
 
五、蛋白质显像
         蛋白质显像的一个最主要的目的是验证蛋白质是否转移到膜上。染色是显示印迹膜上蛋白质的最简单方法。染色可用于:
1、验证蛋白质已经转移到膜上
2、确定各泳道加样量是否相等
3、评价整体转膜效率,尤其是使用新缓冲液系统或蛋白样品时。
         最常用的可逆染料是丽春红S,它是一种水溶性染料,可将蛋白染红,使其短时显现,但在随后的步骤中可被洗掉。
 
操作步骤
1、将膜置于反应盒中(印迹蛋白的一面朝上)
2、加0.5 ml丽春红S染色10秒,观察转印效果。
3、去除染液,双蒸水洗膜两次,每次5分钟。
 
六、免疫检测
         在建立自己样品检测方法时,必须考虑到所有成分及相互作用,必须根据实际经验测试抗体浓度、缓冲液组成、封闭剂和温育时间以确定最佳条件。
 
封闭
         封闭是为了避免抗体与膜的非特异结合。用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点可以降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的标委、也不与抗体或检测试剂有交叉反应。最常见的封闭剂是BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶和Tween-20(0.05 - 0.1%)稀溶液。Tween-20有复性抗原的作用,可提高特异性的识别能力。封闭剂通常溶于适当的缓冲液中,如PBS或TBS。
         在选择封闭剂时,要注意一些细节。例如,脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆球蛋白标记的抗体一起使用,因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素。如果封闭剂含磷酸酶,用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白就会受到影响,因为磷酸酶与印迹膜上的磷酸化蛋白接触可使之躯磷酸化。在封闭液中加入磷酸酶抑制剂可增强磷酸化特异性抗体的信号。最后应注意的是适用于一种抗原-抗体组合的封闭剂不一定适用于另一组合。
封闭液配制:
•  1×TBS-T加入5 % w/v BSA(或脱脂奶粉),实验前配置。
 
漂洗
         漂洗印迹膜可从膜上去除任何未结合抗体,否则会引起高背景和低质量的检测结果。常用Tween-20 PBS或TBS稀释液(0.05% v/v),尤其当抗体不太纯或使用高浓度抗体时更是如此。应注意去污剂浓度不能太高,否则会将膜上的目的蛋白洗脱下来。漂洗次数应根据具体实验来确定。漂洗不足会导致高背景,而过渡漂洗则会洗脱抗体而使信号降低。推荐至少洗膜3次,每次5分钟。
洗膜缓冲液(TBS-T)配制:
•  1 L的1×TBS中,加入1 ml的Tween-20至Tween-20 %浓度为0.1 %。
 
抗体
         封闭后,根据抗原选择相应的一抗与膜一起温育,多抗和单抗都可用。多抗通常以抗血清或亲和纯化抗体的形式提供,而单抗是在腹水或组织培养液中表达。多抗具有便宜、生产周期短、与抗原有很高亲和作用等优点。与多抗相比,单抗具有特异性好、纯度高、效价高等优点。

KCTM化学发光试剂盒
Cat.# KC-420
² 灵敏度高
² 信号持续时间长
² 高性价比
试剂盒包括
•  独特的化学发光底物A液,B液
•  优质二抗一支(抗兔,抗小鼠及抗山羊任选)
         标记的二抗用于免疫印迹检测。尽管可以直接标记一抗,但用二抗有其独特的优点,一种标记抗体(酶-抗体偶联)可用于很多种不同的一抗结合,因而避免了标记很多一抗的需要。另一方面,因为一抗能结合不止一个二抗分子,所以使用二抗可以增强信号。

         应根据一抗的种属来源来选择合适的二抗。例如,若一抗是小鼠单克隆抗体,二抗则选择其它种属来源的抗小鼠抗体。通常不同种属来源的二抗不影响实验,但是若使用的二抗产生高背景,则推荐换另一种属来源的二抗。
         应注意,用天然抗原免疫得到的抗体可能无法识别变性抗原,有时可能需要制备非变性胶来分离蛋白。用缓冲液和封闭液稀释抗体以避免与膜的非特异性结合。抗体稀释液通常含有少量Tween-20或其它去污剂,以避免抗体非特异性聚集。为了得到高信噪比和最大灵敏度,每个具体实验中都需要对一抗和二抗浓度进行优化。一般来说,提高一抗稀释度或降低起始凝胶中蛋白上样量可降低非特异性信号。通过提高二抗稀释度可将整体的高背景降到最低。可采用点印迹法来选择最适的抗原、抗体浓度。
抗体稀释液配制:
•  用于多克隆抗体:1×TBS-T或含5% BSA的1×TBS-T
•  用于单克隆抗体:1×TBS-T或含5%脱脂奶粉的1×TBS-T
 
免疫反应步骤
1、以新鲜配置的封闭液孵育膜,室温振荡20 - 30分钟或者4℃振荡过夜。
2、以封闭液适当稀释一级抗体,用于室温振荡孵育膜1 - 2小时或者4℃振荡孵育过夜。不同抗体按
     其推荐比例稀释。
3、洗膜液洗膜3 - 5次(每次3 - 5分钟)。
4、以封闭液适当稀释HRP标记的二级抗体,加入膜上,室温1小时或4℃过夜振荡孵育。按推荐比
     例稀释不同标记的抗体。
5、洗膜液洗膜3 - 5次(每次3 - 5分钟)。
6、(可选)水冲洗膜4 - 5次。
 
七、化学发光检测
         化学发光检测是利用酶催化底物反应,产生可见光。这种方法检测速度快、安全同时灵敏度与放射性检测相当。印迹膜可以用X光片曝光,也可以直接用与化学发光兼容的成像系统扫描。使用化学发光检测,膜还可进行重复检测。
         KC™化学发光试剂盒检测灵敏度高,背景非常低。其底物是一种高灵敏度增强型底物,用于检测免疫印迹中的辣根过氧化物酶(HRP),这种底物能产生强烈的信号输出,KC™高敏化学发光试剂盒(Cat.# KC-420)可检测到皮克(pg)级的抗原,而KC™超敏化学发光试剂盒(Cat.# KC-425)则可检测飞克(Femtogram,fg)级蛋白。
 
康成产品名称
货号
包装规格
稀释倍数或次数
第二代超敏化学发光试剂盒(Cat.# KC-426)
普通化学发光试剂盒
(Cat.# KC-420)
HRP标记GAPDH
KC-5G5
100 μl
50,000倍
10,000倍
GAPDH mAb
KC-5G4
100 μl
50,000倍
10,000倍
HRP标记β-actin
KC-5A08
100 μl
50,000倍
10,000倍
HRP标记β-tubulin
KC-5T01
100 μl
50,000倍
10,000倍
生物素标记分子量标准
KC-410
250 μl
100次
50次
 
实验步骤

KC第二代超敏化学发光试剂盒
Cat.# KC-426
² 超敏感:可检测Femtogram级的微量蛋白
² 经济:一抗与二抗用量大为减少
² 实惠:价格为进口同类产品的二分之一
试剂盒包括
•  独特的超敏化学发光底物A液,B液
•  优质二抗二支(抗兔,抗小鼠)
•  特制的化学发光增敏反应板一块
1、使用前先配制工作液,以1:1比例混合溶液A和溶液B,一个Mini-blot需配制约1 ml工作液(1
     ml / 50 cm2)。溶液混合均匀后避光放置。
2、取1 ml工作液于化学发光反应板,将膜平铺在工作液上,至完全覆盖工作液,室温孵育5分钟。
3、用镊子从工作液中取下膜(避免用手触碰),滴去多余的工作液,膜的一角轻轻接触纸巾或滤纸
     以完全去除工作液。
     注意:不要使膜变干,因为酶和底物需要在水中反应。
4、将膜置于一坚实平面上如一小玻璃板上,以塑料膜将膜封好,小心不要在板和膜之间以及膜和塑
     料膜之间留下小气泡。
5、在暗室用X光胶片显影Western膜或者用数字成像设备拍照。
6、曝光时间从几秒钟到几分钟不等,或者更长,取决于被检测的抗原量的多少。
7、得到图像结果后,膜可根据需要用于洗脱并重新杂交或者用丽春红染料染色和/或晾干。晾干的
     膜可用一干净可密封的袋子装好长期保存,使用时重新水化杂交。

 
常见问题
问题:信号弱
可能原因
解决方法
封闭剂选择不当
封闭剂可能与待检测蛋白又亲合作用,因而阻碍蛋白检测换一种不同的封闭剂和/或减少封闭剂的量和封闭剂时间
抗体反应时间不够
增加保温反应时间
抗体浓度太低或抗体无活性
抗体液反复冻融或细菌污染会改变抗体滴度或活性。提高抗体浓度或新鲜制备
显色检测中印迹膜已干燥
用显色检测方法时如果对比度差,可能印迹膜已经干燥。再次用水润湿印迹膜以提高对比度
叠氮化物抑制HRP
印迹溶液中禁止使用叠氮化物
 
问题:无信号
可能原因
解决方案
无蛋白转移
检查转移过程中凝胶和膜的定位,使用预染分子量标准检测转移过程
抗原上样量低
印迹前在凝胶中加入更多抗原
抗体浓度过低
增加一抗和二抗浓度
HRP抑制
HRP标记抗体不应使用含叠氮化合物的溶液
一抗用天然蛋白免疫得到
在非变性凝胶中分离蛋白或用抗变性抗原抗体
 
问题:非特异性结合
可能原因
解决方案
一抗浓度过高
提高一抗稀释度
二抗浓度过高
提高二抗稀释度
抗原浓度过高
减少加到凝胶中的蛋白量
SDS导致非特异性结合
转膜后洗膜,去除SDS

Protein
产品信息
SpringBio高通量抗体芯片
Raybiotech细胞因子抗体芯片
免疫印迹优质内参
二级抗体
免疫印迹相关试剂盒
技术服务
RNA-蛋白相互作用
细胞因子抗体芯片及技术服务
TMT标记定量技术
非标定量技术(LFQ)
非标定量磷酸化
TMT定量磷酸化
蛋白-蛋白相互作用
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