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 DNA甲基化与癌症研究
      DNA 甲基化是表遗传学上研究最深入的一种机制,是一种酶介导的化学修饰过程。DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶(DNMT)的作用下,基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳原子共价键结合一个甲基基团。 DNA 甲基化后核苷酸顺序未变, 而基因表达受影响。DNA的甲基化对维持染色体的结构、X染色体的失活、基因印记以及许多人类基因病(如癌症,心血管疾病,糖尿病)发生发展都起重要的作用。因此, 基因启动子区异常甲基化作为一种高灵敏度的生物标志物在多种人类疾病发生发展机制的研究中受到越来越多的重视,是目前新的研究热点之一。
 
DNA甲基化——非基因突变的肿瘤形成机制
      癌症是影响人类的常见疾病。在过去的三十年中,人们已经在分子水平上展开了有关癌症的成因与致病机制探讨。原先人们认为肿瘤的发生主要与基因组DNA的突变有关,而近期的研究结果表明:表观遗传学异常也是肿瘤形成的重要原因。表观遗传改变主要包括DNA甲基化的丢失、获得、以及组蛋白修饰为特征的染色质结构的变化等。这些表观遗传的改变,特别是启动子的超甲基化引起的基因沉默,影响着肿瘤发展的各个阶段。与正常细胞基因组相比肿瘤细胞基因组呈现出整体甲基化水平降低和特定位点基因启动子的甲基化水平升高的趋势。肿瘤的发生过程中细胞基因组的整体甲基化水平降低的机制还知道的不多,但是近期的研究结果表明整体甲基化水平降低可能会引起基因组不稳定、染色质结构改变以及一些基因(原癌基因)表达上升。目前对肿瘤组织表观遗传改变的研究还主要集中在启动子的超甲基化和随后的基因表达降低。
      DNA 甲基化是表遗传学上研究最深入的一种机制,是一种酶介导的化学修饰过程。所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶(DNMT)的作用下,基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳原子共价键结合一个甲基基团(图1)。CpG二核苷酸序列在基因组中出现的比例远低于基因组中其他二核苷酸序列。但是在基因组中有一些长度约0.5-4 kb的区域,这些区域CpG密度很高,称其为CpG岛。56%基因的邻近启动子区域带有CpG岛。在正常的细胞中CpG岛通常是处于非甲基化状态。但是,在癌细胞中,肿瘤相关基因启动子的这些区域发生了超甲基化,这个现象被认为是肿瘤发生过程中最为重要的表观遗传学改变。启动子的甲基化在各个类型的肿瘤的发生中都有被发现,并且和转录水平的基因异常沉默有关。值得注意的是,启动子的超甲基化和基因突变一样是引起肿瘤相关基因表达紊乱的常见因素(如图2所示)。

图1  胞嘧啶甲基化示意图

      理解癌症中表观遗传学改变导致的基因沉默,就必须弄清基因启动子超甲基化关闭基因表达的机制。实验证实,仅仅启动子的甲基化并不能使基因沉默,只有当染色体蛋白结合到甲基化的区域时基因的表达才关闭。一些染色质相关蛋白的复合物是DNA的甲基化与基因表达的沉默的中间环节。基因启动子区域的CpG岛被超甲基化后能结合特异性识别DNA甲基化位点的蛋白质—MBPs(甲基-胞嘧啶-结合蛋白)。转录抑制复合物通过MBPs连接到DNA甲基化位点上,该转录抑制复合物包含组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)。组蛋白在HDAC作用下被高度脱乙酰化。超甲基化的DNA区域与脱乙酰化的组蛋白组装成异染色质结构(其他蛋白也参与到该染色体重塑过程),从而阻断转录因子的结合使基因表达沉默(图2)。

图2  抑癌基因启动子超甲基化关闭基因表达的机制。A:启动子CpG岛未被甲基化,乙酰化的组蛋白与该区域的DNA组装成松散的常染色质,这些区域染色质的构型及组蛋白的乙酰化状态能够促进启动子转录复合物的结合,从而启动基因表达。B:启动子CpG岛超甲基化后,甲基-胞嘧啶-结合蛋白(MBPs)结合于该区域的DNA上。包含有组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)的转录抑制复合物(R)通过MBPs结合于基因启动子区域。组蛋白在HDAC的作用下脱乙酰化。超甲基化的DNA区域与脱乙酰化的组蛋白组装成异染色质结构(其他蛋白也参与到该染色体重塑过程)。转录因子不能结合于启动子上,基因表达沉默。
     癌细胞中广泛的出现的新的CpG岛的甲基位点的形成的一种可能的解释就是在细胞癌化过程中基因组中常染色质和异染色质(非甲基化的DNA区域和甲基化的DNA)区域之间的界限被打乱,从而导致异染色质区域向两侧延伸。一些基因(比如雌二醇受体ESR1),在细胞衰老过程中似乎受到了异染色质向外侧延伸的影响。异染色质区域延伸的机制并不十分清楚,但是这个过程可能反映了细胞中保护CpG岛避免其甲基化的保护屏障的脆弱性。在肿瘤形成发展过程中,这种保护屏障的丧失是时间依赖的过程。因此,衰老-依赖的启动子甲基化可能将癌症发生与衰老过程两者联系起来。
      癌症中基因突变可以导致该基因产物功能的破坏,由此造成的表型效应可能并不能马上检测到。但是,如果子细胞异常地将特定基因突变的后果放大并引进新的突变,子细胞可能获得肿瘤细胞的特征。肿瘤形成和发展阶段该细胞的细胞克隆能够将该突变的基因保留下来。相比较而言CpG岛的超甲基化是一个更加缓慢的渐进的过程,CpG岛边侧的高度甲基化区域的区域界线向该基因的转录起始位点方向移动。各个基因(比如白血病细胞中的CDKN2B基因,乳腺癌及其他肿瘤细胞中编码E-钙粘蛋白的CDH1基因)的甲基化区域延伸程度在细胞之间甚至两个DNA链之间都有所不同。基因的转录沉默的程度取决于该基因启动子CpG岛甲基化的程度。各个细胞之间以及各个DNA单链之间甲基化的程度不同,导致了肿瘤中各个细胞内特定基因的表达水平有所不同。(图3)比如,肿瘤形成的早期阶段启动子超甲基化引起的关键的肿瘤抑制基因(P16)的失活就是这样一个缓慢渐进的过程,在最终发展成癌症的阶段中肿瘤内各个细胞中该基因都有不同程度的失活。P16基因在肿瘤形成早期阶段的失活可能是很多癌症发展过程中的关键因素。
     肿瘤的转移在细胞水平上是一个动态的具有多样性的过程。在肿瘤形成的初级阶段具有多样性的肿瘤细胞群体中有迁移特性的细胞形成了一个细胞亚群。这些细胞迁移到其他的部位的时候,会在这些部位形成新的有转移特性具有多样性的群体。恒定的基因组基因突变并不能产生该类型的细胞多样性。而表观遗传学改变引起的基因表达的沉默可以更好地解释这个细胞动力学过程。与细胞侵袭性相关的基因(CDH1)启动子的甲基化状态在肿瘤组织各细胞中的多样性的证实是该假设的有力证据。CDH1基因失活的肿瘤细胞具有侵袭特性(转移能力)。在早期的肿瘤细胞和癌细胞中细胞-细胞之间在该基因启动子超甲基化状态上的不同导致了细胞内CDH1基因表达水平的差异。前列腺和乳腺癌细胞为细胞侵袭性的多样性的研究提供了实验模型。在体外实验中,通过检测培养细胞的侵袭特性来筛选CDH1基因被高度甲基化,并且表达量最低的细胞。研究者发现在这些癌细胞培育物中也同时存在CDH1启动子甲基化程度降低并且CDH1基因重新恢复表达的细胞。(1)

图3 在癌症中,基因组的突变与表观遗传学的改变介导的基因功能丧失的动力学不同。在一轮DNA复制过程中引入的体细胞基因突变(a图中用红色叉表示)直接导致该等位基因编码的蛋白的功能的丧失。(图a)如果这个突变使细胞获得选择生长优势,这个细胞克隆就能迅速扩增并有可能形成肿瘤。与此不同,表观遗传学的改变导致的基因沉默是一个缓慢的渐进的过程并起始于肿瘤形成早期。在这个过程的早期阶段,某个基因的转录水平缓慢减低,其蛋白产物的量减小。正常细胞中存在避免CpG岛受异染色质向其延伸的保护机制(图中用红色直线表示)。这种保护机制的丧失,导致了CpG岛的甲基化(黑色折线箭头)。保护机制的丧失使得CpG岛中的CpG二核苷酸位点甲基化程度的提高。而不同细胞的相同基因的甲基化程度有所差异,这种差异使得同一肿瘤细胞克隆中相同基因产物表达量的降低程度也有所不同。而基因突变造成的蛋白表达水平降低的肿瘤细胞中,该基因的表达量在各个细胞内是相同的。表观遗传的改变导致的基因表达量的减低模式与基因突变不同,是一个动态的过程。这也是肿瘤,特别是恶性肿瘤的重要特征。实心椭圆形,甲基化的CpG位点;空心椭圆,非甲基化的CpG位点。(3)

DNA甲基化——研究方法与实例
      有关基因启动子异常甲基化与肿瘤发生之间的关系的研究, 目前主要集中在以下4 类基因: 抑癌基因(包括Rb、VHL、p16IN K4a、p15INK4b、p14ARF、p73、BRCA1、APC、FHIT、RARB22、RASSF1A )、DNA修复基因(MGMThMLH1)、肿瘤分子侵袭转移相关基因(E2cadherin、DAPK、TIMP3) 及代谢酶基因(GSTP1)。这些基因涉及细胞间信号转导、细胞周期调控、凋亡、DNA 损伤修复及肿瘤的侵袭转移等过程。几乎所有的人类肿瘤中都存在肿瘤相关基因的异常甲基化(5)。
      2001年M. Esteller 等人对涵盖了肺癌,乳腺癌,结肠癌等15种癌症的600个肿瘤标本进行分析,发现12个重要的肿瘤相关基因的启动子在癌组织中发生了甲基化模式的改变(图4)(2)。结果显示, 每一类型的肿瘤中都同时存在着多种肿瘤相关基因的异常甲基化, 而且不同部位的肿瘤组织中, 各种基因的甲基化发生频率是不同的, 存在着明显的基因——肿瘤类型相关性。胃肠道肿瘤(如结肠癌、胃癌等) 中p16IN K4a、p14ARF、MGMT、APChMLH1基因的甲基化比率较高; 呼吸系统肿瘤(肺癌、头颈部癌) 中p16IN K4a、DAPK、MGMT 基因的甲基化较常见; 乳腺癌、卵巢癌中p16 INK4a、GSTP1、BRCA1、CDH1等基因启动子异常甲基化较为频繁; 而恶性血液系统疾病中基因异常甲基化的情况与其它实体瘤明显不同, 这些肿瘤中p73、p15 的异常甲基化频繁, 这两种基因的异常甲基化在其他肿瘤中则很少见。肿瘤组织中这些基因的启动子超甲基化而关闭表达,从而导致了细胞中多个关键的调控通路发生功能紊乱。因此,显而易见的,研究肿瘤细胞异常的表观遗传谱和弄清遗传图谱一样,能够深化对于不同类型肿瘤的发生及发展过程的理解,并且能够用作鉴别肿瘤类型和亚型的辅助手段(5)。
      近年来,筛选肿瘤细胞基因组中表观遗传改变的技术得到不断的完善和发展。这些技术是在使用甲基化敏感的限制性内切酶的基础上,用CpG岛芯片筛选基因组,从而找出肿瘤细胞中被异常DNA甲基化的区域;同样也能利用基因表达谱芯片筛选出药物处理后肿瘤细胞中表观遗传沉默逆转后重新表达的基因。通过这些新的技术手段,越来越多的肿瘤组织中甲基化模式发生异常改变的基因被发现。比如,通过芯片技术发现因启动子超甲基化引起表达沉默的基因家族。这个基因家族的成员在正常情况下抑制WNT(wingless-related)信号转导途径(与结肠癌的发病有关)。在随后的研究中,研究者发现在所有种类的结肠癌细胞中都有发现这条通路上的一个或者多个基因启动子发生了甲基化(1)。
 

图4对涵盖15类型的癌症的样本(共600例)进行12种重要抑癌基因的启动子超甲基化分析的分析结果柱状示意图。(Colon:结肠;Breast:乳腺;Ovary:卵巢;Uterus:子宫;Lung:肺;Head-neck:头颈;Leukemia:白血病;Lymphoma:淋巴瘤;Brain:脑;Kidney:肾;Bladder:膀胱;Esophagus:食道;Stomach:Pancreas:胰腺;Liver:肝)(2)

      许多研究显示启动子异常甲基化在许多肿瘤的发生过程中是一个频发的早期事件, 因此肿瘤相关基因的甲基化状态是肿瘤发生的一个早期敏感指标, 被认为是一种有前景的肿瘤分子生物标志物(biomarker)。更为重要的是, 癌变细胞可以释放DNA 到外周血中。正常人外周血中都存在纳克级的游离DNA , 当肿瘤产生时, 肿瘤细胞可以释放DNA 到外周血中,并在血清/血浆中富集, 其DNA 含量比正常人外周血中高4 倍。研究发现外周血血浆/血清、肿瘤累及器官相关的体液(如唾液、痰等)中同样可以检测到肿瘤组织中存在的肿瘤相关基因的启动子异常甲基化。(图5)这些生物样品比较容易获得,因此检测其中某些肿瘤相关基因的启动子区甲基化状态, 可以为肿瘤的早期诊断提供非常有价值的信息。与其它类型的肿瘤分子标记物相比, 检测启动子异常甲基化有更多的优点。某一基因在不同类型肿瘤中, 其启动子异常甲基化的区域是相同的, 检测比较方便; 另外与等位基因缺失这样的标志物相比, 异常甲基化是一个阳性信号, 很容易与正常组织中的阴性背景区分。
      Esteller 等检测了22 例非小细胞肺癌(NSCLC) 的肿瘤组织和血清中p16、DAPK、GSTP1及MGM T等基因的启动子区异常甲基化状态, 发现68% (15/22) 的肿瘤组织中存在至少一种基因的启动子甲基化; 而在15 例组织阳性。病例中, 有11 例同时在血清中也检测到了启动子异常甲基化的存在。另有许多研究者也分别从肝癌、头颈部癌、食管癌及结肠癌患者的肿瘤组织和血清中同时检测出了某些肿瘤相关基因的启动子甲基化(4)。Palmisano 等检测了21 例肺鳞癌患者的肿瘤组织和痰液中p16、MGMT 启动子异常甲基化情况, 发现所有痰样品中都存在一种或两种基因的启动子区异常甲基化。其中10 例痰样是在肿瘤确诊后采集的; 另11 例痰样来自有吸烟史或其它暴露的高危人群, 这11 例监测对象在随后5~ 35 月都被确诊为肺癌。而这21 例痰样经痰细胞形态学检验为阳性的仅有4 例。(3)因此检测基因启动子区异常甲基化是一个非常敏感的指标。这些研究结果表明:DNA甲基化的检测可以作为癌症的早期症断和风险评估的手段。而覆盖了全基因组的所有种类的肿瘤的超甲基化分子标记的芯片的问世为癌症的研究和诊断提供了一个有力的工具。

图5 上皮细胞中的CpG岛通常处于非甲基化状态。但是CpG岛内的一些位点随着年龄的增长被逐步甲基化。癌细胞常发生密集的CpG岛甲基化。这种甲基化状态的改变能使肿瘤相关的基因沉默并且有可能导致细胞癌化。肿瘤细胞凋亡和迁移过程中将甲基化的等位基因释放入血浆中。因此能够通过高灵敏度的技术从血清样品中检测到基因组DNA甲基化的变化(1)。

结论和展望:
    
科学界以及制药界已经开始认识到表观遗传学的改变在关闭癌症发生中的重要通路中的作用。勿庸置疑,除了我们已经知道的基因之外这些通路中还有大量的未知基因的失活也受到表观遗传学改变的影响。利用芯片技术与信息学方法进行更加深入的研究有可能加速在癌症中由于超甲基化而沉默的新基因的发现,并且将已知的基因进行分类。全面了解各种肿瘤的甲基化模式,并探讨与临床病理等值表达的关系有助于肿瘤分型,判断预后,早期诊断,并发展一些新的治疗策略。

    (1) Jones, P. A., and Baylin, S. B. (2002) The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat Rev Genet 3, 415-28.
    (2) Esteller, M., Corn, P. G., Baylin, S. B., and Herman, J. G. (2001) A gene hypermethylation profile of human cancer. Cancer Res 61, 3225-9.
    (3) Palmisano, W. A., Divine, K. K., Saccomanno, G., Gilliland, F. D., Baylin, S. B., Herman, J. G., and Belinsky, S. A. (2000) Predicting lung cancer by detecting aberrant promoter methylation in sputum. Cancer Res 60, 5954-8.
    (4) Esteller, M., Sanchez-Cespedes, M., Rosell, R., Sidransky, D., Baylin, S. B., and Herman, J. G. (1999) Detection of aberrant promoter hypermethylation of tumor suppressor genes in serum DNA from non-small cell lung cancer patients. Cancer Res 59, 67-70.
    (5) 姚群峰,周宜开.(2003)基因启动子异常甲基化及其作为肿瘤生物标志物的研究进展.国外医学分子生物学分册 25卷,3期,162-165

Genome/Epigenome
产品信息
DNA甲基化芯片
ChIP-chip
Seq-Star™ DNAClean Beads
Seq-Star™ DNA Size Selection Kit
Seq-Star™ RNAClean and smallEnrich Beads
Seq-Star™ poly(A) mRNA Isolation Kit
Seq-Star™ rRNA Removal Kit
Seq-Star™ Rapid DNA-seq Kit
Seq-Star™ Rapid RNA-seq Kit
Seq-Star™ Small RNA-seq Kit
技术服务
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